Vol. 2 – Núm. 2
Julio – Diciembre - 2019
Extracción de aceite esencial de Origanum vulgare y determinación del efecto
antibacteriano sobre Escherichia coli
Extração de óleo essencial de Origanum vulgare e determinação do efeito antibacteriano
em Escherichia coli
Extraction of essential oil of Origanum vulgare and determination of the antibacterial
effect on Escherichia coli
Marjorie Briggeth Basurto Luzuriaga
1
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
mbbasurto@espe.edu.ec
Ariana Lizbeth Quintero Kajek
2
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
alquintero@espe.edu.ec
Luis Andrés Velásquez Cedeño
3
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
lavelasquez2@espe.edu.ec
Milton Temistocles Andrade Salazar
4
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
mtandrade@espe.edu.ec
Recibido: 10/06/2019
Aceptado: 25/07/2019
Publicado: 24/08/2019
1
Cursando estudios de Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas, sede Santo Domingo.
2
Cursando estudios de Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas, sede Santo Domingo.
3
Cursando estudios de Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas, sede Santo Domingo.
4
Ingeniero en Computación y Ciencias de la Informática, Magister en Docencia Universitaria e Investigación
Educativa, Docente del área de Ciencias Humanas de la Universidad de las fuerzas Armadas ESPE sede Santo
Domingo.
59
Resumen
Los aceites esenciales, conformados por una mezcla de componentes orgánicos volátiles,
han sido utilizados para tratar enfermedades provocadas por bacterias, siendo una de las más
causales Escherichia coli. Por tal motivo, se extrajo aceite esencial de Origanum vulgare y se
determinó su actividad antibacteriana sobre cepas de Escherichia coli top10 in vitro,
empleando tres métodos de extracción: destilación por arrastre de vapor, hidrodestilación y
maceración alcohólica. La actividad antimicrobiana se midió realizando un antibiograma,
utilizando un diseño completamente al azar con tres repeticiones. La maceración alcohólica
tuvo el mayor rendimiento de extracción con un 0.52%, frente al 0.0783% y 0.0087% de la
hidrodestilación y arrastre de vapor, respectivamente. Asimismo, presento el mayor porcentaje
de inhibición con un halo promedio de 2.37 cm. Los componentes fenólicos carvacrol y timol
presentes en el orégano desintegran la membrana de las bacterias provocando la interrupción
del crecimiento.
Palabras Clave: Aceite esencial, Actividad antibacteriana, Escherichia coli top 10, Origanum
vulgare
Abstract
Essential oils, formed by a mixture of volatile organic compounds, have been used to
treat diseases caused by bacteria, one of the most causal Escherichia coli. For this reason,
essential oil of Origanum vulgare was extracted and its antibacterial activity was determined
on strains of Escherichia coli top10 in vitro, using three extraction methods: steam distillation,
hydro distillation and alcoholic maceration. The antimicrobial activity was measured by
performing an antibiogram, using a completely randomized design with three repetitions. The
alcoholic maceration had the highest extraction yield with 0.52%, compared to 0.0783% and
0.0087% of the hydrodistillation and steam drag, respectively. Also, I present the highest
60
percentage of inhibition with an average halo of 2.37 cm. The carvacrol and thymol phenolic
components present in the oregano disintegrate the bacteria's membrane causing the growth to
stop.
Key Words: Essential oil, Antibacterial activity, Escherichia coli top 10, Origanum vulgare
Resumo
Óleos essenciais, formados por uma mistura de compostos orgânicos voláteis, têm sido
usados para tratar doenças causadas por bactérias, uma das Escherichia coli mais causais. Por
este motivo, o óleo essencial de Origanum vulgare foi extraído e sua atividade antibacteriana
foi determinada em linhagens de Escherichia coli top10 in vitro, utilizando três métodos de
extração: destilação a vapor, destilação a hidrogênio e maceração alcoólica. A atividade
antimicrobiana foi medida pela realização de um antibiograma, em delineamento inteiramente
casualizado, com três repetições. A maceração alcoólica teve o maior rendimento de extração
com 0,52%, contra 0,0783% e 0,0087% da hidrodestilação e arraste a vapor, respectivamente.
Além disso, apresento a maior porcentagem de inibição com um halo médio de 2,37 cm. Os
componentes fenólicos carvacrol e timol presentes no orégano desintegram a membrana da
bactéria, fazendo com que o crescimento pare.
Palavras-chave: Óleo essencial, Atividade antibacteriana, Escherichia coli top 10, Origanum
vulgare
Introducción
Los aceites esenciales están conformados por una mezcla de componentes orgánicos
volátiles, encontrándose este generalmente en forma líquida con una consistencia oleosa. Estos
son extraídos por distintos métodos físicos, siendo la hidrodestilación uno de los más utilizados,
(Turek, 2013). Estos aceites poseen de 20 a 60 componentes con diferentes grados de
61
concentración, los cuales se encuentran en las glándulas intercelulares del tejido de las plantas,
semillas, flores, hojas y frutos, (Franco, 2001).
Además de ser ampliamente usados como condimentos los aceites esenciales representan
una gran alternativa dentro de la nutrición y la farmacéutica por poseer propiedades
antimicrobianas, antifúngicas y antioxidantes, (Cavanagh, 2007). Los aceites esenciales
pueden ser usados para tratar enfermedades que frecuentemente son causadas por bacterias,
una de las más causales y conocidas es Escherichia coli, la cual en casos extremos y
dependiendo de si hubo tratamiento o no puede llegar a ocasionar hemorragia intestinal,
trombosis o incluso la muerte. Esta bacteria puede propagarse debido a condiciones de vida
poco salubres y falta de higiene, por lo cual resulta indispensable que los organismos de salud
de cada país establezcan medidas de protección y contención para evitar posibles brotes de E.
coli.
El orégano (Origanum vulgare), es una planta herbácea perenne, robusta, de hojas
carnosas y muy olorosas, cuyo aroma se asemeja mucho al del orégano común (Telma, 2013),
la cual hasta ahora ha sido empleada tradicionalmente con fines medicinales. Sus propiedades
han sido ampliamente estudiadas, siendo las más importantes su actividad antioxidante,
antimicrobiana, antitumoral y antiséptica, también se la considera tónica y digestiva, (Arcila,
Loarca, Lecona, y Gonzalez E, 2004). Sus principales compuestos activos son el carvacrol y el
timol, (Vincenzi, 2004), los cuales son capaces de inhibir el crecimiento de diversas cepas
bacterianas. El objetivo de esta investigación fue el de extraer aceite esencial de orégano
(Origanum vulgare) para determinar su actividad antibacteriana sobre cepas de Escherichia
coli in vitro, estableciendo el planteamiento de que el aceite esencial de orégano efectivamente
inhibirá el crecimiento de Escherichia coli como hipótesis alternativa, y lo contrario como
hipótesis nula.
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Metodología
Diseño experimental
Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) con 5 tratamientos y tres repeticiones
por cada tratamiento, en donde, se estableció como unidad experimental la caja Petri, dando un
total de 15 unidades experimentales. Los tratamientos evaluados como control natural fueron:
aceite esencial de orégano extraído por hidrodestilación, arrastre de vapor y maceración
alcohólica. Además, se evaluó el control químico mediante dos testigos: gentamicina y
streptomicina.
Lugar de ejecución
La ejecución del presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios L
1
y L
2
de la Facultad de Ciencias de la vida de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, sede
Santo Domingo.
Colecta del material vegetal
Se colectaron hojas de orégano (Origanum vulgare), sin signo de enfermedades
evidentes, seleccionadas por un muestreo aleatorio simple en la ciudad de Santo Domingo de
los Tsáchilas.
Métodos de extracción de aceite esencial de Origanum vulgare
Se realizaron tres métodos de obtención de aceite esencial de orégano (OAEO), los cuales
son detallados a continuación:
OAEO mediante destilación con arrastre de vapor.
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Se montó el equipo de arrastre de vapor como se visualiza en la figura 1. En el matraz 1
se colocó agua destilada y bulbos de ebullición. En el matraz 2 se colocaron las hojas de
orégano cortadas en trozos pequeños. Posteriormente, se elevó la temperatura del matraz 1 con
el fin de generar vapor de agua, el cual extraería el aceite esencial contenido en las hojas de
orégano en el matraz 2.
Finalmente, el aceite obtenido se separó manualmente de la parte acuosa del destilado.
Se realizaron tres destilaciones empleando 257.51, 148.4 y 132.1 gramos de hojas de orégano,
respectivamente. La destilación se realizó por 4 horas en cada caso y se obtuvieron destilados
con volúmenes desde los 100 a los 150 mL.
Figura 1. Equipo para destilación por arrastre de vapor. Extracción de aceite esencial de hojas de orégano
(Origanum vulgare). Fuente: Elaboración propia, 2018.
OAEO mediante hidrodestilación
Se montó el equipo de hidrodestilación como se visualiza en la figura 2. En el balón de
destilación se colocaron bulbos de ebullición, hojas de orégano cortadas en trozos pequeños y
finalmente se añadió agua destilada. La unión de la trampa de clevenger al condensador fue
engrasada. Se realizaron tres hidrodestilaciones durante 6 horas empleando 298 gramos de
hojas de orégano en cada caso.
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Figura 2. Equipo de hidrodestilación. Extracción de aceite esencial de hojas de orégano (Origanum vulgare)
unido a un recirculador de agua. Fuente: Elaboración propia, 2018.
OAEO mediante maceración alcohólica.
Para maceración alcohólica, se realizaron tres ensayos, en los cuales se utilizaron 0.181
y 3.68 kg de hojas de orégano para el primero, segundo y tercer ensayo, respectivamente. Las
hojas de orégano fueron secadas a una temperatura de 55°C por 5 días. Luego del secado, se
molieron y se pesaron nuevamente. A continuación, se agregó metanol a razón de 115 mL de
etanol por cada 50g de material vegetal seco. El material vegetal se dejó macerar por 3 días
con agitación periódica para luego ser tamizado utilizando un papel filtro. Al material seco
obtenido se le añadió nuevamente metanol y se dejó macerar por 3 días. Posteriormente, el
macerado se filtró para obtener únicamente la fracción acuosa. Finalmente, la fracción acuosa
se colocó en la estufa a una temperatura de 60°C para evaporar el metanol y obtener el residuo
pastoso de aceite esencial de orégano.
Inhibición del crecimiento bacteriano de Escherichia coli mediante el método de difusión
por disco.
Se prepararon cajas Petri con medio de cultivo agar Muller Hinton enriquecido con una
solución de almidón (0.45 g en 10 mL). Para la inhibición por el método de difusión de disco,
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se procedió a elaborar discos de 1mm de diámetro utilizando papel filtro. Luego, utilizando
una micropipeta se tomó 0.1 mL de la solución bacteriana de E. coli y se dispenso en las
diferentes cajas Petri. A continuación, se extendió por toda la placa utilizando el asa de siembra
en L. Finalmente, se recubrieron los discos con el aceite esencial de orégano y se colocaron en
las cajas Petri, estas se cerraron con parafilm y se procedió a incubarlas a 37°C. También se
realizó un control de E. coli con gentamicina y streptomicina.
Análisis estadístico
Los 15 datos obtenidos de los halos de inhibición fueron sometidos al análisis de
normalidad de varianza y homogeneidad para cada data, mediante la prueba de Shapiro-Wilk,
usando el programa estadístico SPSS, en donde, se les realizó a los datos el Análisis de varianza
(ANOVA) y la prueba de comparación de Tukey al 5%.
Resultados y discusión
Obtención de aceite esencial de orégano (Origanum vulgare)
En los últimos años la Escherichia coli se ha convertido en una de las patologías más
comunes en el trato digestivo de animales y humanos por lo cual esta bacteria se ha vuelto más
difícil de combatir porque adopto nuevas formas de contagio y una resistencia a los
antibióticos. Con lo que se aguarda conseguir nuevas alternativas de inhibición, de antemano
se espera que este apartado científico contribuya con dicha finalidad.
Los métodos convencionalmente hidrodestilación y arrastre de vapor pueden ser
comparados entre si puesto que se puede obtener aceite esencial directamente. El proceso de
hidrodestilación permitió obtener una mayor cantidad de aceite esencial y consecuentemente
un rendimiento superior en comparación con el proceso de arrastre de vapor, con un
66
rendimiento del 0.0783% y 0.0087%, respectivamente. Estos datos pueden visualizarse en la
tabla 1.
Según Álvarez (2012), la diferencia entre los métodos de arrastre de vapor y
hidrodestilación es debido al proceso que se lleva a cabo, en el arrastre de vapor se extrae el
aceite esencial a través del uso de vapor saturado el cual se encuentra a presión atmosférica. A
medida que el vapor hace contacto con la materia vegetal esta se calienta y empieza a liberar
el aceite esencial el cual gracias a que es volátil empieza a evaporarse, siendo así arrastrado
por el vapor hacia el condensador, donde naturalmente dicha mezcla se condensara y enfriara
hasta temperatura ambiente para finalmente ser liberado en forma líquida. El aceite obtenido
estará acompañado de un líquido conocido como hidrosol o agua floral la cual posee pequeñas
concentraciones de los compuestos químicos presentes en el aceite esencial. Asimismo, el
proceso de hidrodestilación en esencia es similar pero con la diferencia de que se utiliza un
equipo conocido como trampa de Clevenger, el cual simplemente cumple la función de separar
el aceite esencial del hidrosol o agua floral.
Por otro parte, la maceración alcohólica con metanol tuvo el mayor rendimiento (0.52%),
este método aparte de obtener el aceite esencial en forma de pasta, permite una mayor
concentración del orégano, ya que en los dos anteriores métodos de hidrodestilación y arrastre
de vapor hubo un extracción de aceite y agua, y no de aceite esencial puro. Cabe mencionar
que se ocupó metanol, ya que este compuesto permite una mayor concentración del aceite
esencial de orégano en el proceso de extracción, (Sainz, 2008).
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Tabla 1:
Parámetros de los métodos de extracción de aceite esencial de Origanum vulgare.
Método
Hojas de
orégano
Cantidad de
aceite/pasta
obtenida
Hidrodestilación
298 g
0.1 mL
297.5 g
0.1 mL
298 g
0.5 mL
Destilación por
arrastre de vapor
257.51 g
0.03 mL
148.4 g
0.01 mL
132.1 g
0.01 mL
Maceración
alcohólica
82.1 g
0.32 g
117.6 g
0.87 g
117.02 g
0.52 g
Nota: Se especifica la cantidad de hojas de orégano empleadas, cantidad de aceite/pasta y el rendimiento obtenido
en cada método de extracción.
Inhibición del crecimiento bacteriano de Escherichia coli mediante el método de difusión
por disco
Según los trabajos realizados por Bastos (2001) el aceite de orégano es eficaz frente la
bacteria Escherichia coli con un 0,35 % de inhibición por discos, donde los halos están
comprendidos con un diámetro de 29,5 ± 3,4 mm, siendo el halo mínimo de inhibición 4 mm.
En el ensayo realizado por Torres (2008), se comprobó el efecto antibacteriano del aceite
esencial de orégano en una concentración del 75%, mencionando que los componentes más
importantes son el Carvacrol y Timol ya que se les atribuye su acción antimicrobiana debido a
que destruye las membranas celulares de las bacterias causando su permeabilidad y seguido se
da la salida de iones inorgánicos, ATP, y ácidos nucleicos, entre otros.
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Tabla 2:
Comparación de medias de los halos de inhibición obtenidos por el método de difusión de discos
en los cinco tratamientos, sobre la cepa de Escherichia coli top 10.
Método
Tratamiento
Diámetro del halo de inhibición (mm)
Difusión en discos
Replicas
Media
1
2
3
AEO por hidrodestilación
1.30
1.60
2.90
1.93
AEO por arrastre de vapor
1.30
1.50
1.20
1.33
AEO por maceración alcohólica
2.50
2.40
2.20
2.36
Gentamicina
2.50
2.50
2.50
2.50
Streptomicina
0.94
0.94
0.94
0.94
Nota: El diámetro máximo de inhibición es de 55 mm de diámetro, puesto que es el diámetro que posee la caja
Petri. Los tratamientos de AOE (aceite esencial de orégano) son de control natural, mientras que los tratamientos
de gentamicina y streptomicina, corresponden a los testigos de control químico.
En la tabla 2 se analizó que en la primera y segunda replica la mayor inhibición de
Escherichia coli fue con el método de maceración, a comparación de hidrodestilación y
arrastre de vapor que obtuvieron una cantidad de inhibición igual en la primera réplica, y en la
segunda diferenciaron en un centímetro, respectivamente. Aunque, en la réplica 3, la mayor
inhibición fue de hidrodestilación, a pesar de que no diferenció en gran medida con la
inhibición de maceración. Además, se analizó la inhibición con los controles de Escherichia
coli: gentamicina y streptomicina, en donde, la mayor inhibición en las tres replicas fue con la
gentamicina.
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Figura 3. Halos de inhibición. Actividad antibacteriana de aceite esencial Origanum vulgare y controles de
inhibición en Escherichia coli en función de los diámetros de inhibición del crecimiento de la bacteria. Medias
con letras iguales no fueron significativamente diferentes (DMS, 0.05). Los tratamientos aplicados en la
inhibición en la unidad experimental fueron: a) streptomicina, b) gentamicina, c) aceite esencial de orégano por
hidrodestilación y d) aceite esencial de orégano por maceración alcohólica.
Se realizó un diseño completamente al azar (DCA) como análisis estadístico, donde se
obtuvo una significación de p = 0.0075 (p<0.05), lo que hace que ese resultado sea altamente
significativo entre los tratamientos de orégano junto con los antibióticos aplicados, obteniendo
así grupos independientes. El antibiótico estreptomicina que no inhibe a la especie de
Escherichia coli presentó una menor inhibición, mientras que la gentamicina que si inhibe
dicha especie bacteriana presento una mayor inhibición frente a los tratamientos, como se
muestra en la figura 4.
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Figura 4. Tratamiento estadístico. Actividad antibacteriana de aceite esencial Origanum vulgare y controles de
inhibición en Escherichia coli en función de los diámetros de inhibición del crecimiento de la bacteria. Medias
con letras iguales no fueron significativamente diferentes (DMS, 0.05)
Cabe mencionar que entre los factores que afectan el efecto antibacteriano del aceite de
orégano podrían estar relacionado el proceso de recolección y de extracción, (Albado, 2001).
Asimismo, se menciona que el extracto de orégano está compuesto de otros compuestos tales
como el linalol y limoneno. Existen bastantes estudios sobre la actividad antimicrobiana de
los extractos de diferentes tipos de orégano. Se ha encontrado que los aceites esenciales de las
especies del género Origanum presentan actividad contra bacterias gram negativas como
Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae; y las gram positivas como Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis y el género Listeria, (Lozano, 2004). Según los resultados
obtenidos de Ruiz (2017), los aceites esenciales de orégano presentan mayor inhibición en
bacterias gram negativas.
Conclusión
Se comprobó que el aceite esencial extraído de Origanum vulgare sirve como tratamiento
para la inhibición de la bacteria Escheerichia coli top 10, puesto que posee compuestos
orgánicos derivados del isopreno en sus hojas, como el carvacol y timol, los cuales desintegran
la membrana de las bacterias provocando la interrupción de su crecimiento.
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El método de hidrodestilación tuvo un rendimiento del 0.0783%, mientras que el de
arrastre de vapor tuvo un rendimiento del 0.0087%. el rendimiento de maceración alcohólica
fue del 0.52%, por lo cual se puede concluir que fue el mejor método de extracción de aceite
esencial, tanto en cantidad como en concentración, en segunda estancia se obtuvo al aceite
obtenido por hidrodestilación y por último el de arrastre de vapor, puesto que el aceite se
encontraba bastante diluido.
Cabe mencionar que, el método de extracción esencial de orégano que produjo una mayor
inhibición con la técnica de difusión de discos fue el de maceración, puesto que contenía
metanol en su composición.
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